Javascript е деактивиран във вашия браузър. Когато JavaScript е деактивиран, някои функции на този уебсайт няма да работят.
Регистрирайте вашите специфични данни и специфични лекарства, които ви интересуват, и ние ще съпоставим предоставената от вас информация със статии в нашата обширна база данни и ще ви изпратим PDF копие по имейл своевременно.
Контролирайте движението на магнитни наночастици от железен оксид за целенасочено доставяне на цитостатици
Автор Торопова Y, Королев Д, Истомина М, Шулмейстер Г, Петухов А, Мишанин В, Горшков А, Подячева Е, Гареев К, Багров А, Демидов О
Яна Торопова,1 Дмитрий Корольов,1 Мария Истомина,1,2 Галина Шулмейстер,1 Алексей Петухов,1,3 Владимир Мишанин,1 Андрей Горшков,4 Екатерина Подячева,1 Камил Гареев,2 Алексей Багров,5 Олег Демидов6,71Национален медицински изследователски център „Алмазов“ към Министерството на здравеопазването на Руската федерация, Санкт Петербург, 197341, Руска федерация; 2 Санкт Петербургски електротехнически университет „ЛЭТИ“, Санкт Петербург, 197376, Руска федерация; 3 Център за персонализирана медицина, Държавен медицински изследователски център „Алмазов“, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Санкт Петербург, 197341, Руска федерация; 4ФГБУ „Научноизследователски институт по грип име А. А. Смородинцев“ Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Санкт Петербург, Руска федерация; 5 Институт по еволюционна физиология и биохимия „Сеченов“, Руска академия на науките, Санкт Петербург, Руска федерация; 6 Институт по цитология на РАН, Санкт Петербург, 194064, Руска федерация; 7INSERM U1231, Факултет по медицина и фармация, Университет Бургундия-Франш-Конте в Дижон, Франция Комуникация: Яна Торопова Национален медицински изследователски център „Алмазов“, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Санкт Петербург, 197341, Руска федерация Тел. +7 981 95264800 4997069 Имейл [email protected] Предистория: Обещаващ подход към проблема с цитостатичната токсичност е използването на магнитни наночастици (МНЧ) за целенасочено доставяне на лекарства. Цел: Да се ​​използват изчисления за определяне на най-добрите характеристики на магнитното поле, което контролира МНЧ in vivo, и да се оцени ефективността на магнетронното доставяне на МНЧ към миши тумори in vitro и in vivo. Използва се (MNPs-ICG). Проведени са in vivo изследвания на интензитета на луминесценция при туморни мишки, със и без магнитно поле в мястото на интерес. Тези изследвания са проведени върху хидродинамичен скелет, разработен от Института за експериментална медицина към Държавния медицински изследователски център „Алмазов“ към Министерството на здравеопазването на Русия. Резултат: Използването на неодимови магнити насърчава селективното натрупване на MNP. Една минута след прилагане на MNPs-ICG на мишки с тумор, MNPs-ICG се натрупва главно в черния дроб. При отсъствие и наличие на магнитно поле това показва неговия метаболитен път. Въпреки че е наблюдавано увеличение на флуоресценцията в тумора при наличие на магнитно поле, интензитетът на флуоресценция в черния дроб на животното не се променя с течение на времето. Заключение: Този тип MNP, комбиниран с изчислената сила на магнитното поле, може да бъде основа за разработване на магнитно контролирано доставяне на цитостатични лекарства до туморните тъкани. Ключови думи: флуоресцентен анализ, индоцианин, наночастици от железен оксид, магнетронно доставяне на цитостатици, насочване към тумора
Туморните заболявания са една от основните причини за смърт в световен мащаб. В същото време, динамиката на нарастваща заболеваемост и смъртност от туморни заболявания все още съществува. 1 Използваната днес химиотерапия все още е едно от основните лечения за различни тумори. В същото време, разработването на методи за намаляване на системната токсичност на цитостатиците е все още актуално. Обещаващ метод за решаване на проблема с токсичността ѝ е използването на наномащабни носители за насочване на лекарствената концентрация. 2 Този метод позволява подобряване на ефективността и насочването на химиотерапевтичните лекарства към туморните тъкани, като същевременно се намалява тяхната системна токсичност.
Сред различните наночастици, разглеждани за целенасочено доставяне на цитостатични агенти, магнитните наночастици (МНЧ) са от особен интерес поради своите уникални химични, биологични и магнитни свойства, които осигуряват тяхната гъвкавост. Следователно, магнитните наночастици могат да се използват като нагревателна система за лечение на тумори с хипертермия (магнитна хипертермия). Те могат да се използват и като диагностични средства (магнитно-резонансна диагностика).3-5 Използвайки тези характеристики, комбинирани с възможността за натрупване на МНЧ в определена област, чрез използването на външно магнитно поле, доставянето на целенасочени фармацевтични препарати открива перспективи за създаването на многофункционална магнетронна система за насочване на цитостатици към мястото на тумора. Такава система би включвала МНЧ и магнитни полета, за да контролира движението им в тялото. В този случай, както външни магнитни полета, така и магнитни импланти, поставени в областта на тялото, съдържаща тумора, могат да се използват като източник на магнитно поле.6 Първият метод има сериозни недостатъци, включително необходимостта от използване на специализирано оборудване за магнитно насочване на лекарства и необходимостта от обучение на персонал за извършване на хирургични интервенции. Освен това, този метод е ограничен от високата цена и е подходящ само за „повърхностни“ тумори близо до повърхността на тялото. Алтернативният метод за използване на магнитни импланти разширява обхвата на приложение на тази технология, улеснявайки използването ѝ върху тумори, разположени в различни части на тялото. Както отделни магнити, така и магнити, интегрирани в интралуминалния стент, могат да се използват като импланти за увреждане на тумори в кухи органи, за да се осигури тяхната проходимост. Според наше собствено непубликувано изследване обаче, те не са достатъчно магнитни, за да осигурят задържането на MNP от кръвния поток.
Ефективността на магнетронното доставяне на лекарства зависи от много фактори: характеристиките на самия магнитен носител и характеристиките на източника на магнитно поле (включително геометричните параметри на постоянните магнити и силата на магнитното поле, което те генерират). Разработването на успешна технология за доставяне на клетъчни инхибитори с магнитно насочване трябва да включва разработването на подходящи магнитни наноразмерни носители на лекарства, оценка на тяхната безопасност и разработване на протокол за визуализация, който позволява проследяване на движението им в тялото.
В това проучване математически изчислихме оптималните характеристики на магнитното поле за контрол на магнитния наноразмерния лекарствен носител в тялото. Възможността за задържане на наночастици (MNP) през стената на кръвоносния съд под въздействието на приложено магнитно поле с тези изчислителни характеристики беше изследвана и в изолирани кръвоносни съдове на плъхове. Освен това, синтезирахме конюгати на MNP и флуоресцентни агенти и разработихме протокол за тяхната визуализация in vivo. При in vivo условия, в туморни моделни мишки, беше изследвана ефективността на натрупване на MNP в туморните тъкани, когато се прилагат системно под въздействието на магнитно поле.
В in vitro проучването използвахме референтния MNP, а в in vivo проучването използвахме MNP, покрит с млечнокисел полиестер (полимлечна киселина, PLA), съдържащ флуоресцентен агент (индолециянин; ICG). В този случай, MNP-ICG е включен в (MNP-PLA-EDA-ICG).
Синтезът и физичните и химичните свойства на MNP са описани подробно другаде. 7,8
За да се синтезират MNPs-ICG, първо бяха получени PLA-ICG конюгати. Използвана е прахообразна рацемична смес от PLA-D и PLA-L с молекулно тегло 60 kDa.
Тъй като PLA и ICG са киселини, за да се синтезират PLA-ICG конюгати, първо е необходимо да се синтезира амино-терминален спейсър върху PLA, който помага на ICG да се хемисорбира към спейсъра. Спейсърът е синтезиран с помощта на етилендиамин (EDA), карбодиимиден метод и водоразтворим карбодиимид, 1-етил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDAC). PLA-EDA спейсърът се синтезира, както следва. Добавя се 20-кратен моларен излишък от EDA и 20-кратен моларен излишък от EDAC към 2 mL 0.1 g/mL PLA хлороформен разтвор. Синтезът е проведен в 15 mL полипропиленова епруветка на клатачка при скорост 300 min-1 в продължение на 2 часа. Схемата на синтез е показана на Фигура 1. Повторете синтеза с 200-кратен излишък от реагенти, за да оптимизирате схемата на синтез.
В края на синтеза, разтворът се центрофугира при скорост 3000 min-1 в продължение на 5 минути, за да се отстранят излишните утаени полиетиленови производни. След това към 2 mL разтвор се добавят 2 mL от 0,5 mg/mL разтвор на ICG в диметилсулфоксид (DMSO). Бъркалката се фиксира на скорост на разбъркване 300 min-1 в продължение на 2 часа. Схематичната диаграма на получения конюгат е показана на Фигура 2.
В 200 mg MNP добавихме 4 mL PLA-EDA-ICG конюгат. Използвахме шейкър LS-220 (LOIP, Русия), за да разбъркаме суспензията в продължение на 30 минути при честота 300 min-1. След това тя беше промита три пъти с изопропанол и подложена на магнитно разделяне. Използвахме ултразвуков диспергатор UZD-2 (FSUE NII TVCH, Русия), за да добавим IPA към суспензията за 5-10 минути при непрекъснато ултразвуково действие. След третото промиване с IPA, утайката беше промита с дестилирана вода и ресуспендирана във физиологичен разтвор с концентрация 2 mg/mL.
За изследване на разпределението на размерите на получените наночастици (MNP) във водния разтвор беше използвано оборудването ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Великобритания). За изследване на формата и размера на MNP беше използван трансмисионен електронен микроскоп (TEM) с катод с полева емисия JEM-1400 STEM (JEOL, Япония).
В това изследване използваме цилиндрични постоянни магнити (клас N35; с никелово защитно покритие) и следните стандартни размери (дължина на дългата ос × диаметър на цилиндъра): 0,5×2 мм, 2×2 мм, 3×2 мм и 5×2 мм.
In vitro изследването на транспорта на наночастици (MNP) в моделната система е проведено върху хидродинамично скеле, разработено от Института по експериментална медицина към Държавния медицински изследователски център „Алмазов“ към Министерството на здравеопазването на Русия. Обемът на циркулиращата течност (дестилирана вода или разтвор на Кребс-Хенселейт) е 225 mL. Като постоянни магнити се използват аксиално намагнитени цилиндрични магнити. Поставете магнита върху държач на 1,5 mm от вътрешната стена на централната стъклена тръба, като краят му е обърнат към посоката на тръбата (вертикално). Дебитът на флуида в затворения контур е 60 L/h (съответстващо на линейна скорост от 0,225 m/s). Разтворът на Кребс-Хенселейт се използва като циркулиращ флуид, тъй като е аналог на плазмата. Коефициентът на динамичен вискозитет на плазмата е 1,1–1,3 mPa∙s. 9 Количеството MNP, адсорбирано в магнитното поле, се определя спектрофотометрично от концентрацията на желязо в циркулиращата течност след експеримента.
Освен това са проведени експериментални изследвания върху подобрена маса за механика на флуидите, за да се определи относителната пропускливост на кръвоносните съдове. Основните компоненти на хидродинамичната опора са показани на Фигура 3. Основните компоненти на хидродинамичния стент са затворен контур, който симулира напречното сечение на моделната съдова система, и резервоар за съхранение. Движението на моделната течност по контура на модула за кръвоносни съдове се осигурява от перисталтична помпа. По време на експеримента се поддържа изпаряване и необходимият температурен диапазон, както и се следят системните параметри (температура, налягане, дебит на течността и pH стойност).
Фигура 3. Блокова схема на установката, използвана за изследване на пропускливостта на стената на каротидната артерия. 1 - резервоар за съхранение, 2 - перисталтична помпа, 3 - механизъм за въвеждане на суспензия, съдържаща MNP, в контура, 4 - разходомер, 5 - сензор за налягане в контура, 6 - топлообменник, 7 - камера с контейнер, 8 - източник на магнитно поле, 9 - балон с въглеводороди.
Камерата, съдържаща контейнера, се състои от три контейнера: външен голям контейнер и два малки контейнера, през които преминават рамената на централния контур. Канюлата се вкарва в малкия контейнер, контейнерът се нанизва върху малкия контейнер, а върхът на канюлата е здраво завързан с тънка тел. Пространството между големия и малкия контейнер се запълва с дестилирана вода, а температурата остава постоянна благодарение на връзката с топлообменника. Пространството в малкия контейнер се запълва с разтвор на Кребс-Хенселейт, за да се поддържа жизнеспособността на клетките на кръвоносните съдове. Резервоарът също се запълва с разтвор на Кребс-Хенселейт. Системата за подаване на газ (въглерод) се използва за изпаряване на разтвора в малкия контейнер в резервоара за съхранение и камерата, съдържаща контейнера (Фигура 4).
Фигура 4 Камерата, в която е поставен контейнерът. 1 - Канюла за спускане на кръвоносните съдове, 2 - Външна камера, 3 - Малка камера. Стрелката показва посоката на моделната течност.
За определяне на индекса на относителна пропускливост на съдовата стена е използвана каротидната артерия на плъх.
Въвеждането на суспензия от MNP (0,5 mL) в системата има следните характеристики: общият вътрешен обем на резервоара и свързващата тръба в контура е 20 mL, а вътрешният обем на всяка камера е 120 mL. Външният източник на магнитно поле е постоянен магнит със стандартен размер 2×3 mm. Той е инсталиран над една от малките камери, на 1 cm от контейнера, с единия край, обърнат към стената на контейнера. Температурата се поддържа на 37°C. Мощността на ролковата помпа е настроена на 50%, което съответства на скорост от 17 cm/s. Като контрола, пробите са взети в клетка без постоянни магнити.
Един час след прилагането на дадена концентрация на MNP, от камерата е взета течна проба. Концентрацията на частиците е измерена със спектрофотометър, използвайки Unico 2802S UV-Vis спектрофотометър (United Products & Instruments, САЩ). Като се вземе предвид абсорбционният спектър на суспензията на MNP, измерването е извършено при 450 nm.
Съгласно указанията на Rus-LASA-FELASA, всички животни се отглеждат в специални съоръжения, свободни от патогени. Това проучване отговаря на всички съответни етични разпоредби за експерименти и изследвания върху животни и е получило етично одобрение от Националния медицински изследователски център „Алмазов“ (IACUC). Животните са пили вода на воля и са били хранени редовно.
Проучването е проведено върху 10 анестезирани 12-седмични мъжки имунодефицитни мишки NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, САЩ) с тегло 22 g ± 10%. Тъй като имунитетът на имунодефицитните мишки е потиснат, имунодефицитните мишки от тази линия позволяват трансплантация на човешки клетки и тъкани без отхвърляне на трансплантата. Еднокотилата от различни клетки са разпределени на случаен принцип в експерименталната група и са били съвместно размножавани или систематично изложени на постелката на други групи, за да се осигури равно излагане на общата микробиота.
Клетъчната линия на човешки рак HeLa се използва за създаване на ксенотрансплантационен модел. Клетките са култивирани в DMEM, съдържаща глутамин (PanEco, Русия), допълнена с 10% фетален говежди серум (Hyclone, САЩ), 100 CFU/mL пеницилин и 100 μg/mL стрептомицин. Клетъчната линия е любезно предоставена от Лабораторията за регулиране на генната експресия към Института за клетъчни изследвания на Руската академия на науките. Преди инжектиране, HeLa клетките са отстранени от културалната пластмаса с разтвор на трипсин:версен 1:1 (Biolot, Русия). След промиване, клетките са суспендирани в пълна среда до концентрация от 5×106 клетки на 200 μL и са разредени с матрикс на базалната мембрана (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, върху лед). Приготвената клетъчна суспензия е инжектирана подкожно в кожата на бедрото на мишката. Използвайте електронни шублери за наблюдение на растежа на тумора на всеки 3 дни.
Когато туморът достигна 500 mm3, в мускулната тъкан на експерименталното животно близо до тумора беше имплантиран постоянен магнит. В експерименталната група (MNPs-ICG + тумор-M) беше инжектирана 0,1 mL суспензия от MNP и изложена на магнитно поле. Нетретирани цели животни бяха използвани като контрола (фон). Освен това бяха използвани животни, инжектирани с 0,1 mL MNP, но не имплантирани с магнити (MNPs-ICG + тумор-BM).
Флуоресцентната визуализация на in vivo и in vitro проби беше извършена на биоимиджър IVIS Lumina LT серия III (PerkinElmer Inc., САЩ). За in vitro визуализация, към ямките на плаката беше добавен обем от 1 mL синтетичен PLA-EDA-ICG и MNP-PLA-EDA-ICG конюгат. Като се вземат предвид флуоресцентните характеристики на ICG багрилото, е избран най-добрият филтър, използван за определяне на светлинния интензитет на пробата: максималната дължина на вълната на възбуждане е 745 nm, а дължината на вълната на емисия е 815 nm. За количествено измерване на интензитета на флуоресценцията на ямките, съдържащи конюгата, беше използван софтуерът Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.).
Интензитетът на флуоресценция и натрупването на MNP-PLA-EDA-ICG конюгата бяха измерени in vivo в туморни моделни мишки, без наличието и прилагането на магнитно поле в мястото на интерес. Мишките бяха анестезирани с изофлуран, след което 0,1 mL MNP-PLA-EDA-ICG конюгат беше инжектиран през опашната вена. Нетретираните мишки бяха използвани като отрицателна контрола за получаване на флуоресцентен фон. След интравенозно приложение на конюгата, животното се постави на нагревателна повърхност (37°C) в камерата на флуоресцентния апарат IVIS Lumina LT серия III (PerkinElmer Inc.), като същевременно се поддържа инхалация с 2% анестезия с изофлуран. Използвайте вградения филтър на ICG (745–815 nm) за откриване на сигнала 1 минута и 15 минути след въвеждането на MNP.
За да се оцени натрупването на конюгат в тумора, перитонеалната област на животното беше покрита с хартия, което позволи да се елиминира ярката флуоресценция, свързана с натрупването на частици в черния дроб. След изучаване на биоразпределението на MNP-PLA-EDA-ICG, животните бяха хуманно евтаназирани чрез свръхдоза изофлуранова анестезия за последващо отделяне на туморните области и количествена оценка на флуоресцентното лъчение. Използван е софтуерът Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) за ръчна обработка на анализа на сигнала от избраната област на интерес. За всяко животно бяха направени три измервания (n = 9).
В това проучване не определихме количествено успешното зареждане на ICG върху MNPs-ICG. Освен това не сравнихме ефективността на задържане на наночастици под въздействието на постоянни магнити с различни форми. Освен това не оценихме дългосрочния ефект на магнитното поле върху задържането на наночастици в туморните тъкани.
Наночастиците доминират, със среден размер от 195,4 nm. Освен това, суспензията съдържа агломерати със среден размер от 1176,0 nm (Фигура 5А). Впоследствие, порцията е филтрирана през центробежен филтър. Дзета потенциалът на частиците е -15,69 mV (Фигура 5B).
Фигура 5 Физически свойства на суспензията: (A) разпределение на размера на частиците; (B) разпределение на частиците при дзета потенциал; (C) TEM снимка на наночастици.
Размерът на частиците е основно 200 nm (Фигура 5C), съставени от единична MNP с размер 20 nm и PLA-EDA-ICG конюгирана органична обвивка с по-ниска електронна плътност. Образуването на агломерати във водни разтвори може да се обясни с относително ниския модул на електродвижещата сила на отделните наночастици.
За постоянните магнити, когато намагнитването е концентрирано в обема V, интегралният израз се разделя на два интеграла, а именно обема и повърхността:
В случай на проба с постоянно намагнитване, плътността на тока е нула. Тогава изразът за вектора на магнитната индукция ще приеме следния вид:
Използвайте програмата MATLAB (MathWorks, Inc., САЩ) за числени изчисления, академичен лиценз на ETU „LETI“ номер 40502181.
Както е показано на Фигура 7 Фигура 8 Фигура 9 Фигура 10, най-силното магнитно поле се генерира от магнит, ориентиран аксиално от края на цилиндъра. Ефективният радиус на действие е еквивалентен на геометрията на магнита. При цилиндрични магнити с цилиндър, чиято дължина е по-голяма от диаметъра му, най-силното магнитно поле се наблюдава в аксиално-радиална посока (за съответния компонент); следователно, двойка цилиндри с по-голямо съотношение на страните (диаметър и дължина) адсорбцията на MNP е най-ефективна.
Фиг. 7 Компонентата на интензитета на магнитната индукция Bz по оста Oz на магнита; стандартен размер на магнита: черна линия 0,5×2 мм, синя линия 2×2 мм, зелена линия 3×2 мм, червена линия 5×2 мм.
Фигура 8 Компонентата на магнитната индукция Br е перпендикулярна на оста на магнита Oz; стандартният размер на магнита: черна линия 0,5×2 мм, синя линия 2×2 мм, зелена линия 3×2 мм, червена линия 5×2 мм.
Фигура 9 Компонентата Bz на интензитета на магнитната индукция на разстояние r от крайната ос на магнита (z=0); стандартен размер на магнита: черна линия 0,5×2 мм, синя линия 2×2 мм, зелена линия 3×2 мм, червена линия 5×2 мм.
Фигура 10 Компонента на магнитната индукция по радиалната посока; стандартен размер на магнита: черна линия 0,5×2 мм, синя линия 2×2 мм, зелена линия 3×2 мм, червена линия 5×2 мм.
Специални хидродинамични модели могат да се използват за изучаване на метода на доставяне на наночастици (MNP) до туморните тъкани, концентриране на наночастици в целевата област и определяне на поведението на наночастиците при хидродинамични условия в кръвоносната система. Постоянни магнити могат да се използват като външни магнитни полета. Ако игнорираме магнитостатичното взаимодействие между наночастиците и не разглеждаме модела на магнитния флуид, е достатъчно да оценим взаимодействието между магнита и единична наночастица с дипол-диполно приближение.
Където m е магнитният момент на магнита, r е радиус-векторът на точката, където се намира наночастицата, а k е системният фактор. В диполното приближение полето на магнита има подобна конфигурация (Фигура 11).
В еднородно магнитно поле наночастиците се въртят само по силовите линии. В нееднородно магнитно поле върху тях действа сила:
Където е производната на дадена посока l. Освен това, силата придърпва наночастиците в най-неравномерните области на полето, т.е. кривината и плътността на силовите линии се увеличават.
Следователно е желателно да се използва достатъчно силен магнит (или магнитна верига) с очевидна аксиална анизотропия в областта, където се намират частиците.
Таблица 1 показва способността на единичен магнит като достатъчен източник на магнитно поле да улавя и задържа MNP в съдовото легло на полето на приложение.